日本血吸虫热休克蛋白70（HSP70）的生物信息学分析及原核表达及纯化-特种医学与军事医学-医学新闻-世界最新医学信息文摘
日本血吸虫热休克蛋白70（HSP70）的生物信息学分析及原核表达及纯化
何思杰1，杨琳琳1，吕志跃1，魏洁1，吴忠道1
中山医学院寄生虫学教研室，广州（510080）
【摘要】目的 从日本血吸虫尾蚴cDNA中扩增热休克蛋白（heat shock protein 70， HSP70），利用生物信息学方法预测其结构和功能特征, 用以指导实验研究。方法 利用生物信息学网站的各种在线分析工具，预测日本血吸虫HSP70(schistosoma japonicum HSP70,SjHSP70)基因编码蛋白质的各种结构与功能特征，分析该蛋白与人类相应HSP70的一致性。克隆该基因，并对其进行原核表达及纯化。结果该基因全长1962bp, 编码653个氨基酸, 预测有较稳定的理化性质，具有ATP 酶活性、含有多个T细胞及B细胞表位，并能在原核中能稳定的表达。结论 日本血吸虫HSP 70是一个进化上高度保守的蛋白，定位在线粒体，具有多个抗原位点，提示该蛋白能作为抗血吸虫病的候选疫苗分子。
【关键词】日本血吸虫；HSP70；生物信息学；原核表达
1 引言
日本血吸虫病主要流行于亚洲的中国、日本、菲律宾、印度尼西亚、泰国等地，我国血吸虫病主要分布于长江沿岸城市的湖沼地区及大山区的12个省（市、自治区），2006年全国血吸虫病疫情调查及资料整理统计分析显示[1]，我国大部分流行地区已消灭或控制了血吸虫病，但尚有448个血吸虫病流行县（市、区），约67万慢性患者。对血吸虫的防治关键在于抗血吸虫病疫苗开发和研究。致弱尾蚴疫苗的研究始于上世纪60年代末，大量实验证明，经辐照致弱的侵袭性曼氏血吸虫或日本血吸虫尾蚴能诱导实验动物产生高达90%的保护性免疫力，以至于到现在仍是受公认的最高效、稳定的抗血吸虫病疫苗[2-4]。因此本实验室利用双向凝胶电泳（2-D）的方法，寻找出70余种日本血吸虫正常尾蚴与紫外致弱尾蚴的差异表达蛋白，经过质谱分析，有20余种蛋白得到确定，其中有一种高表达蛋白确定为热休克蛋白70（HSP70）。
热休克蛋白，又称应激蛋白，是一系列在进化学上极为保守的蛋白，具有分子伴侣的作用，能协助新生蛋白折叠、纠正错误折叠蛋白、参与信号转导，并在蛋白跨膜中起重要作用[5-7]。HSP70 除了具有分子伴侣作用以外，还是重要的促炎分子及佐剂分子。能被抗原提呈细胞（Antigen Presentated Cell，APC）识别，引起前炎症反应及获得性免疫应答,同时也能协同其他抗原分子，激活非特异性的免疫应答，在抗肿瘤治疗中重组的人 HSP 70已作为佐剂进入临床二期研究[8]。
我们根据2-D的结果，在NCBI网站上搜索到目的蛋白的基因及蛋白序列，并对目的蛋白进行生物信息学预测，结果显示目的蛋白理化性质稳定，具有分子伴侣活性及ATPase 功能域，并具有多个抗原表位。我们设计引物，以本实验室已经过RT-PCR方式得到的日本血吸虫尾蚴cDNA为模板，扩增得到全长HSP70编码基因，将基因克隆到原核表达载体中，并在E.coli 中原核表达并纯化目的蛋白。
2 材料与方法
2.1 材料
日本血吸虫尾蚴cDNA；rTaq 酶（5U/μl），dNTP（10mM），TAKARA DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，均为宝生物工程有限公司（大连，TAKARA）产品；pET 28a质粒；Bam H I (10U/μl)、EcoR I(10U/μl)、T4 连接酶(5U/μl)，均为Fermentas公司产品；His 柱，novagen公司产品。
2.2 方法
2.2.1 SjHSP70序列的确定
通过质谱得到HSP70蛋白质在NCBI 网站上的登陆号为为 P08418，通过tBLASTn，寻找出对应的基因序列，accession No.为AY813185。
2.2.2 通过蛋白分析专家系统Expasy(http://ca.expasy.org/ ) 所提供的蛋白组学和序列分析工具。
2.2.2.1 ProtParam: 预测蛋白质的理化性质, 如分子量、等电点、氨基酸组成、摩尔消光系数、重组产物在细菌、酵母和哺乳动物细胞中的半衰期、在溶液中的稳定性等。
2.2.2.2 MotifScan：预测一级结构中糖基化、脂酰化、磷酸化、硫酸化、GPI 锚着位点等修饰位点和模序。
2.2.2.3 TargetP：分析亚细胞定位序列等特征序列, 包括:分泌信号肽（SignalP）、质体(ChloroP)、线粒体(MITOPROT)、过氧化物酶体（PTS1）等。
2.2.2.4 InterPro Scan：扫描一级结构中包含的结构和功能域特征序列, 如结合Ca2+的EF 手性结构, 亮氨酸拉链等[9]。
2.2.3 细胞表位预测
2.2.3.1 通过http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/ 预测B 细胞表位。
2.2.3.2 通过http://www.syfpeithi.de/预测T细胞表位。
2.2.4 同源性比对：通过BLASTp，寻找出与目的蛋白一致性最高的蛋白。
2.2.5 PCR 扩增及测序鉴定
根据已知的HSP70在NCBI上的accession No.为AY813185，设计引物，以RT-PCR方式得到的日本血吸虫尾蚴cDNA为模板，对目的基因进行扩增，上游引物为：5’ CGGGATCCATGTCTCGTAACTTGTTGTTA 3’，下游引物为:5’ CCGGAATTCTTACTGCTTCTCCTGTTTAG 3’，扩增体系为：2.0μl cDNA，上、下游引物（20mM）各1.0μl ，dNTP（10mM） 4μl，10× PCR Buffer 5μl，rTaq 酶0.4μl，以灭菌去离子水补充体积至50μl 。反应条件为：95℃ 预变性 5min，95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物送宝生物工程有限公司（大连）测序。
2.2.6 克隆及纯化
把PCR产物及pET 28a质粒双酶切，酶切体系为：PCR产物/pET 28a质粒 0.5μg，Bam H I 0.5μl，EcoR I 0.5μl，10×Tango Buffer 4μl，灭菌去离子水补足体系到20μl，37℃水浴5h。以TAKARA DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0 试剂盒回收酶切后产物（根据试剂盒使用说明使用）。分别加入PCR酶切后产物100ng，pET 28a质粒酶切后产物100ng，T4连接酶0.5μl，10×Ligation Buffer 2μl，以灭菌去离子水补充体积至20μl，22℃水浴1h。把连接产物转化大肠杆菌BL21。以卡那霉素筛选，挑取转化后的单克隆，经PCR扩增、Bam H I及EcoR I双酶切重组质粒及测序。在经过确证的重组后pET-28a-SjHSP70/BL21中加入1mM IPTG，在37℃，250rpm，5h，诱导目的蛋白表达，以SDS-PAGE进行蛋白质电泳。以6M尿素溶解经IPTG诱导后的菌体沉淀，12000rpm离心15min，得到的上清液以His 柱进行纯化。
3 结果
3.1 蛋白质的理化性质
HSP 70 的分子量为71425.9，等电点是6.25；不含半胱氨酸；在280 nm 处的摩尔消光系数为22 015 M- 1·cm- 1, 0.1% 浓度( 1g/l) 的Abs为0.308；当成熟肽N 端的一个氨基酸为蛋氨酸时, 在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰期为30 h, 在酵母和大肠杆菌中体内表达的半衰期分别大于20h 和10 h；在溶液中的不稳定指数为37.37,低于域值40, 在溶液中性质稳定。脂肪族指数84.85, 总亲水性-0.408, 蛋白质总体疏水性较高。
3.2 翻译后修饰与结构的特征性序列
模序（Motif)分析结果显示, SjHSP70含有13个潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2) 磷酸化位点：72～75、125～128、230～233、244～247、451～454、457～460、516～519、531～534、600～603、609～612、638～641、642～645及648～651；8个潜在的蛋白激酶C( PKC)磷酸化位点：117～179、443～445、516～518、600～602、609～611、621～623及647～649；6个潜在的N-肉豆蔻酰位点：34～39、208～213、272～277、402～407、428～433及527～532；3个潜在的糖基化位点：89～92、175～ 178及438～441；1个酪氨酸激酶磷酸化位点：623～629；1个潜在的亮氨酸拉链结构：413～434；1个潜在的酰基化位点：101～104。
3.3 亚细胞定位
该蛋白只含有线粒体锚定序列，不含分泌信号肽，未发现过氧化酶体、溶酶体等亚细胞定位序列。
3.4 InterPro Scan 扫描一级结构中包含的结构和功能域特征序列
InterPro Scan 分析该氨基酸序列属于分子伴侣蛋白DnaK，含有Actin-like ATPase 功能域。
3.5 B细胞表位及MHC I类分子结合位点预测
B细胞表位预测显示该目的蛋白有8个潜在的B细胞表位，分别为：50～67、76～87、174～186、381～394、484～494、577～585、602～611及634～653；14个潜在的MHC I 类分子结合位点：第16、130、138、211、212、300、301、354、409、414、456、537、568、621位氨基酸。
