养肺活血方对肺纤维化大鼠ERK1/2和NFκ-B信号通路的影响[1]-中医中药学与误诊误治-医学新闻-世界最新医学信息文摘
养肺活血方对肺纤维化大鼠ERK1/2和NFκ-B信号通路的影响[1]
龚婕宁 郭海 魏凯峰 董丽霞
南京中医药大学基础医学院，江苏南京 (210029）
摘要：目的：探讨养肺活血方对博来霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织ERK1/2和NFκ-B表达的影响。方法：采用气管内注入博莱霉素A5建立大鼠肺纤维化模型。将大鼠随机分组，分别给予养肺活血方等相应的药物干预，28天后取肺组织，用免疫组化法检测其表达。结果：养肺活血方能明显降低大鼠肺组织ERK1/2和NFκ-B的表达(P<0.01)。结论：影响ERK1/2和NFκ-B信号通路，可能是中药养肺活血方治疗肺纤维化的机制之一。
关键词：肺纤维化 养肺活血方 细胞外信号调节激酶 转录调节因子核因子
中图分类号：R56
1.引言
肺纤维化是一种发病隐匿、进展迅速、病死率高且治疗效果欠佳的慢性肺部疾患，其病因和发病机制未明。近年来的研究表明，肺纤维化的发生发展与许多致纤维化信号通路的激活密切相关。细胞外信号调节激酶ERK1/2途径是细胞增殖与分化信号传导的共同通路,是成纤维细胞等许多细胞中多种信号向核内传递的共同途径；NFκ-B是一种多功能的核转录因子,具有广泛的生物活性，在肺纤维化过程中均起到关键性作用[1]。“养肺活血方”是名老中医王灿晖教授的临床验方，治疗肺纤维化取得了可靠疗效。我们的前期研究观察到，该方能明显减轻博莱霉素诱导的大鼠肺泡炎和肺间质纤维化程度，其作用机制与减少肺组织TGF-β、CTGF表达有关。为了进一步探讨该方对肺纤维化信号通路的作用，本研究观察了该方对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织ERK1/2和NFκ-B表达的影响，以期深入阐明该方治疗肺纤维化的作用机理。
2.实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验动物 选用清洁级SD大鼠，体重200±20g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物合格证0037253。
2.1.2实验药品与仪器
实验药品 活血方由丹参、川芎等组成，按比例称取后，煎制浓缩为含生药0.35g/ml的合剂；益气活血方由黄芪、丹参等组成，煎制浓缩为含生药0.53g/ml的合剂；养阴活血
方由沙参、丹参等组成，煎制浓缩为含生药0.495g/ml的合剂；养肺活血方黄芪、沙参、丹参、川芎等组成，煎制浓缩为含生药0.675g/ml的合剂，由南京中医药大学中医治法实验室制备，中药饮片由南京药业股份有限公司提供。
地塞米松片：0.75mg/片，批号070403，天津天药药业有限公司生产，用蒸馏水配制成0.0000405g/ml的溶液。
博莱霉素A5：8mg/支，批号070501，天津太河制药有限公司生产。
实验仪器 石蜡切片机（德国 Leica公司生产）；光学显微镜（日本Olympus公司生产）； 全自动图像获取系统Olympus DP71（日本Olympus公司生产）。
实验试剂：兔抗大鼠ERK1/2和NFκ-B多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2.2 实验方法
2.2.1 动物分组 大鼠常规适应性饲养3d后，随机分为7组：假手术组、模型组、地塞米松组、活血组、益气活血组、养阴活血组和养肺活血组。
2.2.2 造模及给药 按文献方法[2] 制备肺纤维化大鼠模型。将博莱霉素A5用生理盐水配制成5mg/ml浓度，用10%水合氯醛0.3ml/100g麻醉大鼠后，颈部皮肤消毒，剪去颈部鼠毛，行颈正中切口，分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺注入博莱霉素A5 5mg/kg，立即将动物直立并旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，然后缝合皮肤。假手术组动物在同样麻醉条件下气管内注入等量生理盐水。术后第2天开始每天灌胃给药，假手术组和模型组予5‰羧甲基纤维素钠(CMC钠)溶液1ml/100g体重；地塞米松组予等容积地塞米松蒸馏水溶液0.000405g/Kg·d；各治疗组予等容积中药合剂，活血组剂量3.5g/Kg·d，益气活血组剂量5.3g/Kg·d，养阴活血组剂量4.95g/Kg·d，养肺活血组剂量6.75 g/Kg·d。
2.2.3 标本采集 术后28天，以10%水合氯醛0.3ml/100g麻醉大鼠后处死，剖取两肺，剪除气管、主支气管，将左肺组织用冰盐水冲洗3遍，滤纸吸干水分，10%的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，常规脱蜡，用免疫组化SABC法检测ERK1/2和NFκ-B的表达。采用光学显微镜和全自动图像获取系统Olympus DP71在高倍镜视野(×400)下随机选取5个区域(视场)，测量并记录每个视野阳性染色的平均光密度 (IOD)值，作为该片的代表值。
2.2.4 统计学处理 所有数据均以均数±标准差（ ±ｓ）表示，采用SPSS11.5 统计软件分析，多组间采用单因素方差分析。
3.结 果
3.1养肺活血方对博来霉素致肺纤维化大鼠ERK1/2表达的影响
模型组大鼠肺组织ERK1/2的表达明显高于假手术组，具有统计学意义(P<0.01)。各中药治疗组肺组织ERK1/2的表达明显低于模型组，具有统计学意义(P<0.01)。见表1。
表1 养肺活血方对博来霉素致大鼠肺纤维化ERK1/2的影响（ ±s）
下略
[1] 本课题得到教育部博士点基金项目和江苏省高校自然科学基础研究面上项目资助
课题名称：养肺活血方对肺纤维化细胞凋亡及信号通路干预作用的研究
批准号：20060315005
课题名称：养肺活血方对肺纤维化成纤维细胞的干预机制
课题编号：08KJB360008
