反义Ki-67 和Bcl-2真核细胞双表达载体的构建及鉴定-论著（临床医学及研究）-医学新闻-世界最新医学信息文摘

反义Ki-67 和Bcl-2真核细胞双表达载体的构建及鉴定

卢天龙，陈建国，韩跃武，张庆华

(兰州大学基础医学院医学生物化学与分子生物学研究所，甘肃 兰州 730000)

Construct and identif of the eukaryotic co-e­xpression vector of human Ki-67 and Bcl-2 genes

LU Tian-long, CHEN Jian-guo, HAN Yue-wu, ZHANG Qing-hua

Department of Biochemistry and Molecular Biology, Lanzhou Medical College, Lanzhou University,

Lanzhou 730000, China

Abstract: Aim To construct the recombinant co-e­xpression vector carrying antisense RNA to Ki-67 and Bcl-2 genes and which will be used to resist tumers. Methods RT-PCR was used to amplify the orF of Ki-67 and Bcl-2 cDNA from total RNA of Gastric carcinoma cell line SGC-7901. The Ki-67 cDNA fragment and the Bcl-2 cDNA fragment were inserted into pMD18-T simple vector respectively. The Ki-67 was digested with BamH I and Cla I and the Bcl-2 was digested with EcoR I and Xho I. Then the Ki-67 cDNA fragment and the Bcl-2 cDNA fragment were inverted insertion into the multiple cloning sites 1 and 2 (mcs1 and mcs2) of the eukaryotic co-e­xpression vector pVITRO2 respectively. To construct the single e­xpression plasmid pVITRO2-AsKi-67 and pVITRO2-AsBcl-2. Then the Bcl-2 cDNA fragment was inverted insertion into the mcs2 of the vector pVITRO2-AsKi-67, To construct.the co-e­xpression vector pVITRO2-AsKi-67-Bcl-2.Results The restriction endonucleases digestion and sequencing suggested that the eukaryotic co-e­xpression vector pVITRO2-AsKi-67-

Bcl-2 and the single gene e­xpression plasmids pVITRO2-AsKi-67 and pVITRO2-AsBcl-2 Conclusion The co-e­xpression vector pVITRO2-AsKi-67-Bcl-2 and the single gene e­xpression plasmids pVITRO2-AsKi-67 and pVITRO2-AsBcl-2 were constructed successfully.

Key words: Ki-67；Bcl-2；Bicistronic vector pVITRO2；antisense RNA

摘 要：目的 构建反义Ki-67和Bcl-2双表达载体用于肿瘤基因治疗的研究。方法 从SGC-7901细胞总RNA中逆转录扩增Ki-67和Bcl-2 cDNA，T-A克隆到pMD18-T Simple载体。Ki-67经BamH Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切，Bcl-2经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，分别反向插入pVITRO2 的多克隆位点1 (mcs1) 和2 (mcs2)，构建单表达质粒pVITRO2-AsKi-67和pVITRO2-AsBcl-2，再将Bcl-2 EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，反向插入pVITRO2-AsKi-67的mcs2，构建pVITRO2-AsKi-67-Bcl-2双表达质粒。结果 限制性内切酶和测序表明单表达质粒pVITRO2-AsKi-67和pVITRO2-AsBcl-2以及双表达质粒pVITRO2-AsKi-67-Bcl-2构建成功。结论 本研究成功构建了pVITRO2-AsKi-67和pVITRO2-AsBcl-2单表达质粒，及pVITRO2-AsKi-67-Bcl-2双表达质粒。

关键词：Ki-67；Bcl-2；双顺反子载体pVITRO2；反义RNA

中图分类号：R73-36

从肿瘤的诱发到进展是一个多阶段、多因素的复杂过程，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。随着分子生物学各项技术的发展，反义核酸治疗肿瘤日益受到人们的重视。反义核酸是通 过Watson-Crick 碱基互补原理，与目的基因或mRNA杂交，从而阻止基因的表达，抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡，达到治疗目的。但是大多数研究表明单基因的反义核酸对肿瘤细胞抑制效果不佳，而多基因联合治疗效果较好[1~4]。本

研究正是着眼于此，旨在构建反义双靶区重组载体pVITRO2-AsKi-67-Bcl-2及单表达质粒pVITRO2-AsKi-67和pVITRO2-AsBcl-2，为探讨双基因反义封闭对肿瘤细胞的影响打下基础。

1 材料与方法

1.1主要材料

真核细胞双顺反子载体pVITRO2和潮霉素Hygromycin B购自InvivoGen公司，SGC-7901本实验室保存，总RNA 提取试剂盒、质粒抽提及胶回收纯化试剂盒购于上海生物工程公司, pMD18-T-simple载体、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、LATaq 酶、EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ、BamH Ⅰ和Cla Ⅰ购自大连宝生物公司。T4 DNA连接酶为Fermentas公司产品。Ki-67上游引5′-TCCATCGATG

GACTTTGGGTGCGACTT-3′，5′ 端引入酶切位点Cla I；下游引5′-TCCGGATCCTGG

CTCCTGTTCACGTATT-3′，5′ 端引入酶切位点BamH I，扩增产物大小514bp。Bcl-2上游引5’-CCTCTCGAGAAGGATGGCGC

ACGCTGG-3’，5’端引入酶切位点Xho I；下游引5’-CCGGAATTCTTGGGGCAGGC

ATGTTGACT-3’，5’端引入酶切位点EcoR I ，扩增产物762bp。由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1总RNA 的提取

按试剂说明书操作。提取物经甲醛琼脂糖变性电泳，观察提取RNA的完整性；吸光度OD260/OD280测定，估计RNA 的浓度和纯度。

1.2.2 RT-PCR

按Takara公司的逆转录试剂盒说明，逆转录合成cDNA第一链(1stcDNA)。Ki-67 PCR反应体系为：Premix Taq 25μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，1stcDNA 3μL，双蒸水补足至总体积50μL；反应条件为94℃预变性5min，94℃30s、60℃30s、72℃45s(35个循环)，72℃延伸7 min； Bcl-2 PCR反应体系为：2×GC bufferⅠ25μl， dNTP 8μL(2.5 mmol/L)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，1stcDNA 3μL，的LA Taq 0.5μL(5 U/μL)，双蒸水补足至总体积50μL；反应条件为94℃预变性5 min，94℃30s、66℃30s、72℃60s(40个循环)，72℃延伸7 min。各取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.3 E.coli DH5a感受态细胞的制备

按文献[5]氯化钙法制备。

1.2.4克隆载体的构建、转化宿主菌及酶切鉴定

PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收、纯化，与pMD18-T Simple载体连接，转化大肠杆菌DH5α，涂平板，蓝白筛选阳性菌落。挑取单个菌落培养，小量质粒制备，双酶切鉴定克隆载体pMD18-T-Ki-67和pMD18-T-

Bcl-2。

1.2.5重组单表达质粒的构建、转化宿主菌及酶切鉴定

pMD18-T-Ki-67经BamHⅠ和ClaⅠ双酶切，pMD18-T-Bcl-2经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化；pVITRO2同样分别经BamHⅠ和ClaⅠ，EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收纯化。分别将Ki-67和Bcl-2反向插入pVITRO2载体的多克隆位点1(mcs1)和2(mcs2)中，转化大肠杆菌DH5α，涂平板，潮霉素Hygromycin B筛选阳性菌落。挑取单个菌落培养，小量质粒制备，双酶切鉴定重组单表达质粒pVITRO2-AsKi-67和pVITRO2-AsBcl-2。

1..2.6重组双表达质粒的构建、转化宿主菌及酶切鉴定

将pMD18-T-Bcl-2和pVITRO2-AsKi-67经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收纯化目的片段。反向将Bcl-2插入单表达质粒pVITRO2-AsKi-67的多克隆位点2(mcs2)中，然后转化大肠杆菌DH5α，涂平板，潮霉Hygromycin B筛选阳性菌落。挑取单个菌落培养，小量质粒制备，酶切鉴定。

1.2.7目的基因序列分析

取pVITRO2-AsKi-67、pVITRO2-AsBcl-2和pVITRO2-AsKi-67-Bcl-2重组质粒，由上海生工公司完成测序。

2 结果

2. 1 SGC-7901细胞总RNA的提取及电泳鉴定

提取的总RNA 吸光度检测得OD260/OD280值为1.94，表明总RNA较纯，经甲醛琼脂糖变性电泳，可见28S、18S 和5S 3条带，提示RNA 较完整，可用于RT-PCR。(图1)

下略