IFN-α联合IL-15对CML患者NK细胞表面NKG2D受体表达的影响
来源: | 作者:admin | 发布时间:2012-6-19 访问人数: 232

IFN-α联合IL-15对CML患者NK细胞表面NKG2D受体表达的影响


李举亨,张连生,柴晔

1兰州大学第二医院血液科,甘肃兰州(730000)


摘要 目的 应用IFN-α联合IL-15共同作用于慢性粒细胞白血病(CML)来源的NK细胞,以促进NK细胞表面的NKG2D的表达及NK细胞的活化。方法  采集慢性粒细胞白血病初治患者及正常人的外周血分离NK细胞,流式细胞仪检测表面NKG2D的表达,分别加入IFN-α,IL-15及IFN-α联合IL-15培养36小时后再次流式细胞仪检测NK细胞表面NKG2D的表达,ELISA法检测培养液上清IFN-γ的浓度。MTT法检测NK细胞杀伤活性 结果 CML慢性期未缓解患者NK细胞表面NKG2D的表达,IFN-γ的分泌以及NK细胞的杀伤活性均显著低于正常对照组,但经IFN-α联合IL-15作用后,NKG2D的表达,IFN-γ的分泌以及NK细胞的杀伤活性均显著提高(P < 0. 05),接近正常对照组。结论IFN-α联合IL-15可有效促进CML患者NK细胞表面NKG2D的表达,活化NK细胞,增强NK细胞的杀伤活性。

关键词:IFN-α;IL-15;NK细胞;NKG2D

中图分类号:R733.7

自然杀伤细胞(NK cell)是机体固有免疫的主要效应细胞,在抵御病原微生物侵袭及肿瘤形成等方面为机体提供一线防御。NKG2D是NK细胞表面的一种重要的活化受体,它的表达对于NK细胞的活化,免疫监视及杀伤功能具有重要作用[1]。慢性粒细胞白血病(CML)患者的NK细胞与正常人相比存在着功能上的显著差异[2],NKG2D的表达显著降低,如何提高CML患者体内NK细胞表面的NKG2D的表达,有效的激活和扩增NK细胞对于CML的免疫治疗具有重要意义。IFN-α能有效的活化NK细胞,是NK细胞早期活化,扩增及具有抗肿瘤活性的关键性因子[3]。IL-15是NK细胞最主要的生理性生长因子,对于NK细胞的生长,分化及成熟NK细胞的杀伤作用具有重要作用[4,5]。本文选用细胞因子IFN-α联合IL-15 作用于CML来源的NK细胞,通过上调NKG2D的表达以促进NK细胞的活化及杀伤功能。

1.材料与方法

1.1研究对象及分组 

研究对象 实验组 CML初诊未治慢性期患者8例 男性4例,女性4例,平均年龄39。对照组 健康成人8例,男性4例,女性4例,平均年龄36岁。

实验分组  CML及健康人各分四组A组 空白对照组;B组  IL-15 50ng/ml + NK细胞; C组  IFN-α 2000u/ml +NK细胞; D组  IL-15 50ng/ml + IFN-α 2000u/ml +NK 细胞。

1.2主要试剂

完全培养基:RPMI1640为Hyclone公司产品,胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品,淋巴细胞分离液为上海华精生物高科技有限公司产品,rhIL-15  2ug /支Peprotech公司产品,rh IFN-α 为上海罗氏制药有限公司产品,原液浓度为3×109u/mL,FITC标记的鼠抗人NKG2D抗为eBioscience 公司产品,抗CD56免疫磁珠为Miltenyi Biotec 公司产品,噻唑蓝(MTT)及二甲基亚酚(DMSO)为Sigma 公司产品,IFN-γ  ELISA检测试剂盒为eBioscience 公司产品,K562细胞购自兰州大学基础医学院中心实验室。

1.3试验方法

1.3.1外周血单个核细胞的分离

  采集健康人及初治CML患者外周血20ml,肝素抗凝,Ficoll-Hypaque液梯度离心分离单个核细胞,台盼蓝拒染率>95%,置于完全培养基中备用。

1.3.2免疫磁珠法(MACS)分离NK细胞

将单个核细胞的浓度用含10%血清RPMI-1640调整为4×106 /ml,加入到无菌的塑料平皿中,37℃,5%CO2环境中培养2h后,除去粘附于塑料的单核细胞和B细胞,非粘附细胞与10%血清RPMI-1640液预孵育1h后过尼龙棉柱,B细胞和剩余的单核细胞粘附在尼龙棉柱上,用培养液洗柱,收集洗下的T细胞和NK细胞,用20倍体积的PBS+0.2%BSA溶液重悬后,和包被CD56单抗免疫磁珠混匀置于试管中,4℃冰箱孵育30分钟,置于磁化细胞分离器(MACS)作免疫磁性分离, CD56+NK细胞在磁性作用下吸附管壁,PBS缓冲液洗脱未与磁珠标记的T细胞,收集紧贴管壁的NK细胞,以5ml RPMI-1640液与包被CD56单抗免疫磁珠的NK细胞混合,置37℃,5% CO2孵育箱中过夜,使磁珠从NK细胞上脱落下来,然后再用磁化细胞分离器贴壁分离磁珠,收集悬液中的NK细胞备用。

1.3.3  NK细胞的刺激培养及流式细胞术检测。

将分离好的CML患者及健康人的NK细胞各分为A,B,C,D四组,A组直接采用鼠抗人NKG2D荧光抗体标记,行流式细胞术,检测NK细胞表面NKG2D的表达。另外三组:B组  L-15 50ng/ml + NK细胞; C组  IFN-α 2000u/ml +NK细胞; D组 IL-15 50ng/ml + IFN-α 2000u/ml +NK 细胞,置于37℃,5% CO2条件下培养36小时,然后采用鼠抗人NKG2D荧光抗体标记,流式细胞术检测NK细胞表面NKG2D的表达。

1.3.4  细胞因子的检测

培养36小时后收集A组及B,C,D三组经细胞因子刺激后NK细胞的上清液,ELISA法检测IFN-γ的浓度。

1.3.5  MTT法检测 NK细胞杀伤活性

收集对数生长期K562细胞作为靶细胞,以含5%胎牛血清RPMI1640完全培养液调整细胞数为2×105,加入96孔U型板 ,50ul/孔。收集CML患者空白组和经IFN-α和IL-15刺激的NK细胞各自作为效应细胞,调整细胞浓度,按照不同的效靶比(5:1 , 10:1,20:1,40:1),加入效应细胞混匀,另设单独靶细胞和单独效应细胞对照孔,每组设三个副孔,5%CO2,37 ℃孵育24h后每孔加入MTT 20ul(终浓度0. 5 mg/L),继续培养4小时,平板离心机1 000 rpm离心5 min ,弃上清,加入DMSO150ul,,轻轻振荡10 min 后用MTT显色法以酶联免疫检测仪在570nm处检测OD值, 按以下公式计算杀伤活性:

杀伤活性=[ 1- (实验孔OD570值-效应细胞孔OD570值) /靶细胞孔OD570值]×100%

1.3.6 统计学分析

采用SPSS11.0软件对所得数据进行分析,测量指标以均数±标准差( ±s)描述,多组间均数比较采用方差分析,进一步组间比较采用配对t检验,检验水准取α=0.05。p<0.05时有显著性,p<0.01时有非常显著性。

2.结果

2.1对照组及实验组NK细胞表面NKG2D的表达(%)

本研究结果显示:经流式细胞检测,对照组各组NK 细胞表面NKG2D的表达率分别为A组(24.74 ±2.13),B组(25.25±1.74),C组(26.685 ±2.45), D组(32.23±2.63); 实验组各组NK 细胞表面NKG2D的表达率分别为A组(3.24±1.64),B组(7.36±1.78),C组(12.44 ±2.14),D组(24.75±2.78),CML实验组各组NKG2D表达显著低于正常对照组,试验组各组之间比较:单用IFN-α组及单用IL-15组NKG2D表达均显著高于空白对照组,IFN-α组表达又高于IL-15组,IFN-α联合IL-15组NKG2D表达则明显高于单用IFN-α组及单用IL-15组,实验组各组之间具有显著性意义(p<0.05)对照组各组之间比较:A、B、C三组之间无显著性差异(p>0.05), IFN-α联合IL-15组NKG2D表达则高于A、B、C三组,对照组D组与各组之间比较具有显著性意义(p<0.05)。对照组与实验组各组之间具有显著性意义(p<0.05),但经IFN-α及IL-15联合作用后,实验组D组与对照组A组NKG2D的表达逐渐接近。见表1

 

下略